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抗原的制备
发布日期:2014/10/20      浏览:2675

除完整的细胞可作为抗原外,各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质,也都具有全抗原或半抗原的性质,某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的,可作为这种细胞的一个标志。由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质,有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质,以供科学研究之用。

一、抗原的提取

抗原的制备是一件十分细致的工作,要制备一个高纯度的抗原,需要付出艰巨的努力,制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面:①用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中,如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等;②把混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的,如电泳、超速离心和超滤等。由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质,其分离方法也不一样,就是同一类大分子物质,因选材不同,所使用的方法也很大差别。因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用,所以在提取前必须针对所欲提取的物质,充分查阅文献资料,选用合适的方法。如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质,更需要经过各种方法的比较探索,才能找到一些工作规律和获得预期的效果。

抗原物质的制备,大概要经过如下过程:①料的选择和预处理;②细胞的粉碎(细胞器的分离)。③提取;④纯化;⑤浓缩或干燥,保存。

现分别简述如下:

(一)材料的选择及预处理

选择什么材料主要根据实验目的而定。通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。材料选定后,通常要进行预处理,剔除结缔组织、脂肪组织等,把组织块剪碎。若取材后不立即进行提取,则应冷冻保存,动物组织更要深低温保存。某些容易失活的物质,一般宜采用新鲜材料。

(二)细胞的粉碎

除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外,凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质,都必须把组织和细胞粉碎,使活性物质充分释放到溶液内。不同的组织,细胞的破碎难易不一,因此所使用的粉碎方法也不完全相同。如脑、胰、肝等比较软嫩的组织,用普通匀浆器研磨就行,肌肉、心脏等则需绞碎后再作匀浆。现浆常用的细胞粉碎方法介绍如后。

1.物理法

(1)高速组织捣碎机:通常由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等组成。把材料放于筒内(约占筒内容积的1/3)固定筒盖,开动马达,调速器由慢逐渐增至所需速度。此法适用于内脏组织。

(2)玻璃匀浆器:由一个内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状(球面经过磨砂)玻璃研杆组成。把绞碎的组织置于管内,加适量溶液,插入研杆,用手或电动转动研杆,并上下移动。用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,对大分子的破坏也少。是粉碎少量软嫩材料(脑、胰、肝等)时常用的方法。

(3)超声波处理法:多用于软嫩组织,根据不同组织采用不同频率,处理10~15min,超声波处理时溶液温度升高,使不耐热的物质失活,使用时为防止温度升高,除间歇开机外,还需人工降温,避免溶液内存在气泡。核酸及某些酶对超声波很敏感,要慎用。

(4)反复冻融法:把待碎样品冷却到零下15~20。C,冻固后取出,缓慢解冻,如此反复操作,可使大部分动物性细胞及胞内的颗粒破碎,但也可使生物活性物质失活。

(5)冷热交替法:把材料投入90。C左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内,可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。

2.化学和生物化学法

(1)自溶法:把新鲜材料置于一定的pH和适宜的温度下,利用组织细胞自身的酶系统把组织破坏,使细胞内容物释放出来。动物材料的自溶温度选在0~4℃,需加少量防腐剂,自溶时间较长,不易控制,不常用。

(2)溶菌酶处理法:多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100μg至1mg溶菌酶,37℃,保温10min,细胞就破坏了。此外,蜗牛酶、纤维素酶也被选作破碎细菌细胞之用。

(3)表面活性剂处理法:较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。

(三)抗原的提取

提取、抽提、萃取这3个词的含义基本相同。但一般说来,提取是指在分离纯化前期,将经过处理或粉碎了的细胞置于一定条件和溶剂中,让被提取物充分地释放出来的过程,而抽提则是贯穿于分离纯化的整个过程中,如在制备核酸过程中,用氯仿反复提取蛋白液,用苯酚反复抽提分离DNA和RNA。影响提取的因素主要来自被提取物在提取的溶剂中的溶解度大小以及它由固相扩散到液相的难易。一个物质在某一溶剂中的溶解度大小和该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。一般说来,极性物质易溶于极性溶剂,非极性物质易溶于非极性大分子的等电点远的pH值使溶解度增加。因此,在不同的抗原提取过程中,所选用的溶剂的性质、pH值、离子强度、抽提温度、介电常数等因素是提取成败的重要因素。要达到分离提纯的目的,必须灵活地应用这些因素。

现将蛋白质、核酸、多肽等抗原(半抗原)的提取方法概要叙述于下。

1.蛋白质和酶的提取蛋白质是由许多氨基酸连接而成的高分子物质,分子量从数千至百万。数以千计的蛋白质,按它们的功能可分成两大类,一类是活性蛋白,包括酶、激素蛋白、受体蛋白、运动蛋白、运输和贮存蛋白、防御蛋白等等,另一类是非活性蛋白,如胶原蛋白、角蛋白等,不同的蛋白质由于其结构的差异,它们溶解度也各不相同。大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于有机溶剂乙醇、丙酮、丁醇等。这对选择撮蛋白质的溶剂具有重要意义。

(1)水溶液提取:由于蛋白质大部分溶于水、稀酸和稀碱溶液,因此提取蛋白质以水溶液为主,其中尤以稀盐液和缓冲液对蛋白质稳定性好,溶解度大,氢是最常用的溶剂。应注意下列几点:①盐浓度,常用等渗溶液,尤以0.02~0.05mol/L磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15mol/L氯化钠溶液应用较多。如酵母脱氢酶以0.66mol/L磷酸氢二钠溶液提取,6-磷酸葡萄糖脱氢酶以0.1mol/L碳酸氢钠液提取,脱氧核糖核蛋白在低盐溶液中溶解度小,就要用1mol/L以上的氯化钠液提取,而某些脂肪酶,用水提取比低盐溶液提取效果更好。②pH值的选择对蛋白质提取颇为重要,因为蛋白质的溶解度和稳定性与pH值关系很大。提取液的pH值首先要保证在蛋白质稳定的范畴内,通常在等电点的两侧,碱性蛋白如细胞色素C和溶菌酶选在偏酸一侧,酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶应选在偏碱一侧。③温度:为防止活性蛋白变性、降解而失活,温度通常选在5℃以下。对少数耐温的蛋白质和酶,可适当提高温度,使杂蛋白变性分离,有利于提纯,如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶以及许多多肽激素可选择37~50℃条件下提取,效果比低温提取更好。

(2)有机溶剂提取:一些不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液的蛋白质和酶,常用不同比例的有机溶剂来提取。如用70%~80%乙醇提取麸蛋白;用60%~70%的酸性乙醇提取胰岛素,既可抑制水解酶对胰岛素的破坏,又可除去大量杂蛋白,用丁醇提取某些附于微粒体和线粒体的酶,一些与脂质结合牢固的蛋白质和酶以丁醇提取,效果较好。我国生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸脂酶。丁醇提取法对pH及温度的选择范围较广(Ph3~10),温度由零下2℃~40℃均可。

2.核酸的提取核酸分为两大类:一类为核糖核酸(RNA),另一类为脱氧核糖核酸(DND)。核酸的分子量极大,人数万致亿万。核酸是两性化合物,在一定的等电点。溶于水,其水溶液呈酸性,不溶于乙醇等有机溶剂。细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白。核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中的溶解度有显著区别,有一定浓度范围的氯化钠溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度增加而逐渐下降,当氯化钠浓度为0.14mol/L时,其溶解度仅为水中溶解度的1/100,但当氯化钠浓度再增加时,脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加,氯化钠浓度增加到0.5mol/L时,其溶解度与水中溶解度相似,当氯化钠浓度增加到1mol/L时,它的溶解度比在水中大2倍。核糖核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度,因此常用0.14mol/L氯化钠溶液提取核糖核蛋白,而提取脱氧核糖核蛋白时,则用1mol/L氯化钠溶液。两种核糖核蛋白的溶解度与溶液的pH也有关。当pH为4.2时,脱氧糖核蛋白的溶解度最低,而pH为2.0~2.5时,核糖核蛋白的溶解度最低。所以调节氯化钠溶液的浓度和pH值,可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。

(1)RNA的提取:RNA在细胞中主要有三种类型,即rRNA(核微粒核糖核酸)、tRNA(转移核糖核酸)和mRNA(信使核糖核酸)。mRNA代谢极不稳定,提取时要求条件较严格;tRNA当细胞破碎后,用酸处理得到“pH5”沉淀,即可从中分离tRNA;rRNA占全部RNA的80%以上,比较稳定,一般提取的大分子RNA主要为此部分。核内rRNA常先将细胞核分离后,再进行提取,可避免其他细胞组分RNA的干扰。

RNA的提取,通常是用0.14mol/L氯化钠溶液将组织做匀浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白,而留下含有DNA的细胞核物质,然后用10%醋酸调至pH4.2沉淀,离心弃去上清液,先用0.5mol/L氯化钠溶液,后用水洗涤沉淀,将核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氢钠溶液中,离心,取上清液,调pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化钠溶液洗涤,再一次除去脱氧核糖核蛋白。核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去,核酸留在碳酸氢钠水溶液中,加入乙醇,RNA即以钠盐形式沉淀出来。

提取RNA另一类方法,不须事先用0.14mol/L氯化钠提取核糖核蛋白,而一步将RNA的蛋白质分开,并同时把RNA抽提出来,此类方法是在破碎细胞做成匀浆时,加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠;而现在最常用的方法是直接加入含水苯酚与匀浆一起振荡,DNA和蛋白质沉淀于酚层中,水层中含RNA和多糖,然后用乙醇使RNA沉淀,四种物质一步便可初步分离开。苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法,其应用举例如下:

肝脏rRNA的提取:按肝重(鲜)加入10倍容积苯酚-甲酚混合液(500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸馏水中,另加入0.5g 8-羟基喹啉配成)及10倍容积的0.5%萘-1,5-二磺酸水溶液(g/V)做匀浆后在20℃搅拌20min。

肝脏细胞核内mRNA的提取:先分离细胞核,再将核悬浮于3倍容积的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液(g/V)中匀浆后加入等量90%(g/V)苯酚水溶液(内含0.1%8-羟基喹啉)在2℃振荡提取30min。

酵母tRNA的提取:100g酵母(湿重)加入200ml水,300ml 90%苯酚水溶液,振荡2h,4℃冰箱中过液,使之提取完全。

以上介绍了用冷酚法提取各种RNA的一些实例,近来还有皂土酚法(即除苯酚外还加入皂土吸附蛋白质)提取RNA,据报道比普通酚法提取RNA的生物活性高10倍左右。但应用苯酚法提取核酸时,须注意市售苯酚常含有少量重金属和杂质,可能导致核酸降解,使用时,一般需要减压重蒸。

(2)DNA的提取:DNA主要存在于细胞核中,天然状态的DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白形式存在。人细胞中提取DNA时,一般先获得脱氧核糖核蛋白,再将蛋白质除去,从中分离DNA。常用的方法是以1mol/L氯化钠溶液抽提,得到的脱氧核糖核蛋白溶液与含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振荡,除去蛋白质。或者在组织细胞破碎后以低浓度0.14mol/L氯化钠溶液(也可用0.1mol/L氯化钠加0.05mol/L柠檬酸代替)反复洗涤除去核糖核蛋白,再以1mol/L氯化钠提取脱氧核糖核蛋白,提取仍按氧仿-戊醇抽提法除去蛋白质。两种方法比较,后一种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取DNA时,加入适量去污剂更有助于蛋白质与DNA的分离。

应用苯酚法也可以提取DNA而且不用经过脱氧核糖核蛋白这一步骤,例如大鼠肝匀浆在6%对氨基水杨酸盐溶液内,加入同体积90%苯酚水溶液,室温下提取1h,再经进一步提纯可获得98%~99%纯度的DNA。苯酚法也是目前提取DNA最常用的方法之一。

3.活性多肽及递质的提取大体上与蛋白质的提取方法相似,可参照进行。经典神经递质如去甲肾上腺素、肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等均可化学合成,无需用很多精力去提取。

 
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