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优化ELISA的重点之一在于洗涤
发布日期:2014/4/22      浏览:2021

免疫分析,比如ELISA,一般包含两个或以上的孵育步骤,中间以洗涤隔开。ELISA通常在96孔板中开展,其上包被了结合抗原或抗体。在封闭步骤后,包被后的平板首先与一抗或抗原孵育。随后通过一些洗涤步骤去除未结合(低亲和力)的抗原-抗体复合物。接着,平板与二抗孵育。这种带有酶的抗体与高亲和力的抗原-抗体复合物结合。之后,又是一轮洗涤。最后是添加底物并检测信号。

我们可使用多种底物来检测最终的抗原-抗体复合物。底物分为三类:自然发光、化学发光和荧光。准确说来,ELISA这个词指的是使用自然发光底物的分析。而使用化学发光底物的分析被称为Luminescent Immunoassay(LIA),使用荧光二抗的分析被称为Fluorescent Immunoassay(FIA)。

优化ELISA的重点之一在于洗涤。洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号,从而增加分析的信噪比。每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留,在最后一步产生信号。而不充分的洗涤会导致差异和高背景,从而带来不理想的结果。本文将为你介绍一些利用自动洗板机来洗涤ELISA平板的技巧。

洗涤参数

一些参数会影响洗涤步骤的效果。第一个主要的参数是洗涤量。自动洗板机会分配洗涤液。如果你之前遭遇过高背景,那么不要犹豫,将洗涤量调为高,最好是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到,从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。ELISA板的制造商通常会在试剂盒的使用手册中列出包被量。行业中通常使用的包被量是200 µl。如果你的试剂盒也是这样,那么制造商可能会建议使用300 µl洗涤液进行洗涤,以便清洁整个反应孔的壁。一般来说,洗涤量越高,则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。

洗涤次数的经验法则

第二个影响洗涤效果的主要参数是洗涤循环的量。当然,洗涤次数越多,背景越低。然而,太多次的洗涤会降低信号强度,使其难以测定。通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。不过,ELISA板的制造商会对洗涤次数提出建议。一般而言,制造商包被平板需要的洗涤次数比用户包被的平板要少。对于用户包被的ELISA板,必须优化洗涤次数。

控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液。一般来说,96孔板的每个孔能容纳330至460 µl。不过,有些自动化洗板机可设置程序,分配远远超出这个量的洗涤液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其实很简单,就是在分液的同时打开吸液功能。换句话说,随着分液器分配更多的液体,抽吸器也将液体吸出。这种技术能增加洗涤量,但不会溢出到其他孔中。

抽吸

另外,还有一些参数会影响洗涤步骤的效果。这些参数包括吸液高度和吸入位置,这两者都能调整,以降低背景(残留量)和差异。

残留液体中包含未结合的抗原或抗体,它们会增加背景信号。残留量越小,残留液体越少,转移到下一步的干扰液体也就越少。

吸液高度会明显影响残留量;如果洗涤吸头与反应孔底部的距离稍大,那就会让残留量急剧增加。反之,如果洗涤吸头压着反应孔底部,那么也会使吸液效率降低,残留量增加。

目前的洗板机一般使用两种类型的洗头:刚性和浮动的。浮动洗头中的吸头可在洗涤过程中自由上下移动,而刚性洗头则固定在适当的位置。使用刚性洗头的洗涤操作在优化起来更为复杂,因为你需要非常仔细地调整吸液高度。如果你们实验室使用几种不同的板,那可能会很耗时。在使用浮动洗头时,吸头会降到反应孔的底部。调整高度就不是很重要,因此洗头会下降到底部。

抽吸的位置也对残留量有着重要影响;如果每个孔只使用一个抽吸点(这很常见,因为更快),那么抽吸的位置需要优化。最佳的位置取决于洗头的性状,但它几乎不在反应孔的中间,即使这是所有洗头最常见的默认位置。一般来说,最佳位置在孔中间与孔壁之间的某处。

反应孔的形状也会影响残留量。C形底(平底圆角)的微孔板一般会比那些平底尖角的微孔板残留量更低。

如果没有自动洗板机,采用手工洗涤,那么也需要注意几点。使用8道或12道微量移液器,采用倒吸的方法进行洗涤;不同厂家的洗液不宜相互混用。洗板时需保证微孔板平放,将洗涤液注满各孔,但尽量避免漏液溢液,以每孔300 µl为宜;板洗次数一般为3次,要保证洗板的浸泡时间,每次浸泡时间一般为30-60 秒;尽量减少洗液残留量,推荐每次洗板后进行拍板,并及时更换吸水纸,避免吸水纸的碎屑粘到反应孔内。

ELISA看起来很简单,但是在实际操作过程中,也不能掉以轻心,还是应该仔细检查洗涤步骤,才能获得准确的结果。

 
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