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关于BSA封闭液的使用方法大讨论
发布日期:2013/7/25      浏览:2700

A、请问各位高手,在进行免疫荧光的实验时,浸一抗之前,要用的封闭液中1%的BSA是怎么配制? 封闭液封闭后还用PBS清洗干净再浸一抗吗?

Q1.可以直接用0.02M的PBS配制

Q2.不用PBS清洗干净,直接浸一抗。

B、各位高手,间接法中我想摸索封闭液BSA的最佳浓度,用抗原包被后,用不同浓度的BSA(0.5%,1%,2%,3%)封闭,其他条件固定,测得 OD450nm后,可以看出随着BSA浓度增高,空白值降低,待测样品的OD450nm值也降低,,应该如何确定BSA的最佳浓度?

Q1、你的BSA浓度是否太高?最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的BSA,封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭,封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被,因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面,业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中,封闭一般是不可少的

Q2、判断封闭条件,要考虑在此条件下是否能达到试验要求,即棋盘滴定要满足:阳性样品OD=0.8、阴性样品OD<=0.1,而不是看你待测样品OD变化趋势;过低封闭浓度势必造成本底过高,但过高又会使灵敏度降低,因此只要选择能够满足你试验要求的最低BSA浓度就可以了。另外提醒,洗涤一定要彻底,很重要的。

Q3、包被后封闭前一般要洗涤一遍,以便于洗掉结合不牢固的包被物,防止在实验中影响实验结果;封闭后一定不要洗涤,封闭的目的就是要靠蛋白填补未被包被物占领的空间,另外封闭液一般也具有保护作用。

C、新生牛血清(细胞培养时候加到1640的那一种)可以么,用多大的浓度配比较好啊,是用双蒸水配吗??

Q1、5%,TBS配,BSA是牛血清蛋白,粉剂,不是牛血清哦

Q2、如果不是用biotin-avidin系统的话,用5%脱脂奶粉做封闭液就可以了,廉价,效果也很好。

Q3、封闭液一般是用5%的BSA或者是用5%的脱脂奶粉,溶剂一般使用TBST。做实验的时候,我一直强调这样的一个原理,那就是在了解原理的基础之上,我们完全可以不拘泥于书本,进行创造。就拿这个封闭液来讲,要是单纯的一种封闭效果仍然不好的话,我们完全可以两种合用,我就试过1%的BSA和5%的脱脂奶粉合用进行封闭的事例。所以,搞科学研究是需要我们进行再创造的。

D、BSA交联抗原注射到兔子体内得到一抗,我们Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP标记的二抗。请问,在封闭时,用什么样的封闭液比较好呢?是无蛋白封闭液,还是羊的免疫前血清?

Q1、用5%的脱脂奶粉就可以吧,溶到PBS里,加0.1%的吐温-20.

E、以前买的是专门的一抗稀释液,现在用完了,想换BSA液做封闭液用,因为牛奶太容易坏了,请问可以长期保存么么,谢谢诶,5%可以么,哈哈

Q1、5%BSA配完放冰箱就是了,不过BSA还是有点贵,脱脂奶粉挺好的,现用现配就是了

Q2、BSA确实有点贵,我们在牛奶中加千分之0.2的叠氮钠,放4度可保存2月左右

Q3、NaN3对HRP是强烈抑制剂,如果你使用的是HRP标记~建议要么更换防腐剂,要么延长洗膜时间和次数。其他防腐剂可以选择:硫柳汞钠、极少量的氯仿(1~2ul就可以)

Q4、BSA和牛奶一样,只要不臭,就可以反复使用,而且,有的高手提议放的时间长一点,效果反而更好,也许是溶解的更为彻底的缘故吧。

Q5、都一样吧,在不加防腐剂的情况下,两者的保存时间都不久。我们实验室是牛奶+叠氮钠,虽然用的是HRP,但只要洗膜时间有保证,一般问题不大。加了防腐剂的牛奶可以用蛮长时间的,一个月应该没问题吧。还有一点就是,有的蛋白用BSA会更好,有的蛋白则用牛奶会更好,这是我的个人经验,因为曾经用两种稀释液做过同一个样品同一个蛋白的western,结果证实牛奶的背景更干净,特异性更好,BSA的则会有杂带。

F、请免疫荧光高手指点,我最近做了两次的免疫荧光,均失败,可基本排除是抗体问题,我想问问荧光高手,其中免疫荧光中的封闭液(我用的是5%BSA)跟我的一抗有关吗?封闭液的选择是否和一抗的稀释液需相同,非常感谢!

Q1、封闭液对一抗的结合影响不大,失败的原因不应该是封闭液的原因。一抗可以用封闭液稀释。我们做的经验看,相对组化中一抗的浓度,荧光的稀释比例应该大,即假如组化是1:100,荧光可以试1:50。

G、我的包被的蛋白是用bsa偶联的二十四个多肽,我想问下我用什么做封闭液才行呢?

Q1、BSA或是酪蛋白的封闭液都行,封闭是为了封闭抗原没有占据的空白点,跟你的多肽用何种蛋白偶联没有任何关系!

H、小弟课题牵涉到ELISA检测血清中抗原,在网上看到封闭液的配方又很多种,由于经费有限,小弟想是否也可以效仿western blot 使用脱脂奶粉作配封闭液,不知各位有没有这方面的经验,或者能介绍一下又有效又实惠的配方

Q1、脱脂奶粉做封闭液是相当得可以,另外廉价的封闭液有BSA,酪蛋白等。都可以用来做封闭液。

Q2、放在瓶子里溶解,称量好干粉和其他的盐后,放到瓶子里使劲摇……让蛋白和盐结晶充分混合,再加水很快就溶了。

I、BSA和BSA组分五是不是同一种东西:各位大虾,小弟近来在做蛋白芯片方面的工作,要用BSA封闭片子,但是实验室只有BSA组分五,师兄说BSA组分五就是BSA,我觉得不太对劲,望赐教,先谢过了!

Q1、封闭液组成:封闭液对封闭非特异性活性基团,特别是醛基基团至关重要。大多数情况下封闭液与探针重悬浮溶液、标记溶液是一样的。目前最常用的封闭液组分有BSA、卵清蛋白、脱脂奶粉、PEG20000等。在用IgG、Protein A、Protein G等标记时,优先选用牛血清白蛋白组分五( BSA V );在植物凝集素类探针标记时,应优先选用PEG20000。也有人发现IgG探针标记时脱脂奶粉最佳。如果是用交联蛋白做成的探针,那么封闭液中最好有载体蛋白的成分。

Q2、针对你的问题, BSA组份指的是分子量片段不一样,第V组份和全组份片段不一样。 在最早研究血成分时,将分离到的组分称为组分1、2、3、4、5。后来发现组分5为血清白蛋白,因此BSA又俗称为组分5,而不是说BSA分第几个组份。在制备过程中分组分,并不是说BSA分几个组分,而是将非BSA成分与BSA成分分离开。不仅国内,包括国外也没有将BSA再做组分收集纯化,因为BSA就是一个组分。"组分5" 仅仅是BSA的一个俗称。

 
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