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血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定
发布日期:2013/3/28      浏览:2731

血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定

(本公司常年供应Bovogenγ-球蛋白)

一、原理

血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类:清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白,其中γ-球蛋白含量约占16%,100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离,此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出,清蛋白则仍溶解在溶液中,经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐,会妨碍蛋白质进一步纯化,因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法,其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时,溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔,而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中.因此在洗脱过程中,小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来,从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们等电点的不同可进行分离。α-球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0γ-球蛋白PI7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中,各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时,带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合;带正电荷的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ-球蛋白,从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。 

用上述方法分离得到γ-球蛋白是否纯净,单一?可将纯化前后的γ-球蛋白白进行电泳比较而鉴定之。

二、操作

1)盐析――中性盐沉淀

取正常人血清2.0ml于小试管中,加0.9%氯化钠溶液2.0ml,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml,混匀后于室温中放置10min3000rmin离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液,重复洗涤一次,于沉淀中加入0.0175molL磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.51.Oml使之溶解。此液即为粗提的γ-球蛋白溶液。

(2)脱盐――凝胶柱层析 

①装柱:洗净的层析柱保持垂直位置,关闭出口,柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内,打开柱底部出口,调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部,最后使凝胶床达20厘米高,床面上保持有洗脱液,操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现纹路。在凝胶表面可盖一园形滤纸,以免加入液体时冲起胶粒。

②上样与洗脱:可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整,小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面,关紧下端出口,用长滴管吸取盐析球蛋白溶液,小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口,将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口,小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口,待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次,以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵,流速为0.5ml/min,用部分收集器收集,每管1ml 

③洗脱液中NH4+与蛋白质的检查:取比色板两个(其中一个为黑色背底),按洗脱液的顺序每管取一滴,分别滴入比色板中,前者加20%磺基水杨酸溶液2滴,出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出,由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度;于另一比色板中,加人奈氏试剂应用液l滴,以观察NH4+出现的情况。合并球蛋白含量高的各管,混匀。除留少量作电泳鉴定外,其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。

(3)纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析:用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度,并用0.0175molL磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡,然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上,用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱,收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)

(4)浓缩――DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ-球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定,常需浓缩。收集较浓的纯化的γ-球蛋白溶液2m1,按每ml0.2 0.25gSephadex G25干胶,摇动23min 3000rmin 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。

(5)鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳 取乙酸纤维素薄膜2条,分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。然后比较电泳结果。

三、Bovogenγ-球蛋白

本公司常年供应Bovogenγ-球蛋白,量大优惠。欢迎广大新老客户询价购买。

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BIGD 5.0

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